第一章：转录组+代谢组联合分析概述
联合分析的意义
转录组学关注基因表达水平的变化，能够揭示生物体在特定条件下的调控机制；代谢组学则反映细胞内最终的代谢产物变化，是生命活动最直接的功能体现。将两者结合，可以从“因”与“果”两个层面系统解析生物学过程，显著提升对复杂通路的理解能力。例如，在植物胁迫响应研究中，联合分析可识别关键差异表达基因与其对应的代谢物之间的关联网络，从而锁定核心调控节点。
数据整合策略
实现转录组与代谢组数据融合的关键在于建立统一的生物学语义空间。常用方法包括：
- 基于KEGG通路映射，将差异基因和差异代谢物共同投影至代谢通路中；
- 利用相关性分析（如Pearson或Spearman）构建基因-代谢物共表达网络；
- 采用O2PLS等多组学整合算法进行降维建模。
典型操作流程如下所示：
# 示例：使用R语言计算基因与代谢物间的Spearman相关性
cor_test <- function(expr_data, metab_data) {
# expr_data: 基因表达矩阵（行=样本，列=基因）
# metab_data: 代谢物丰度矩阵（同上结构）
corr_matrix <- cor(expr_data, metab_data, method = "spearman")
p_matrix <- apply(expr_data, 2, function(gene) {
apply(metab_data, 2, function(metab) {
cor.test(gene, metab, method = "spearman")$p.value
})
})
# 返回校正后的显著性结果
padj_matrix <- p.adjust(p_matrix, method = "fdr")
return(list(correlation = corr_matrix, adjusted_p = padj_matrix))
}该脚本输出基因与代谢物之间的相关系数及FDR校正后的p值，用于后续筛选显著关联对。
应用场景举例
| 研究领域 | 典型发现 |
|---|---|
| 农作物抗逆 | 发现ABA通路中关键合成酶与脱落酸积累强相关 |
| 肿瘤代谢重编程 | 揭示HIF1α上调导致乳酸过度生成的机制 |
| 微生物发酵优化 | 定位限速步骤并指导工程菌株改造 |
这种多层次证据互证的方式极大增强了结论的可靠性，已成为系统生物学研究的标准范式之一。
第二章：R语言基础与数据预处理
2.1 转录组与代谢组数据结构解析
转录组数据通常以基因表达矩阵形式呈现，行为基因，列为样本，值为表达量（如FPKM或TPM）。代谢组数据则记录不同样本中代谢物的相对或绝对丰度，常以CSV或NetCDF格式存储。
数据特征对比
- 转录组：高维度（数万个基因），低样本量
- 代谢组：低维度（数百至数千代谢物），但检测平台影响大
| 维度 | 转录组 | 代谢组 |
|---|---|---|
| 数据类型 | RNA表达水平 | 代谢物浓度 |
| 常见格式 | BAM, count矩阵 | mzXML, CSV |
| 批次效应敏感 | 高 | 极高 |
多组学数据整合示例（R）
# 使用MultiOmicQC进行数据对齐
library(MultiOmicQC)
aligned_data <- integrateOmics(
transcriptome = expr_matrix, # 表达矩阵
metabolome = metab_matrix, # 代谢物矩阵
method = "CCA" # 典型相关分析
)上述代码通过典型相关分析（CCA）挖掘两组数据间的潜在关联。expr_matrix和metab_matrix需预先标准化，method参数选择取决于数据分布特性，CCA适用于线性关系建模。
2.2 使用readr和tidyr进行多组学数据读取与清洗
在多组学数据分析中，不同平台产生的数据格式各异，需统一读取并结构化。readr 提供了高效、一致的文本数据导入方式，支持 read_csv()、read_tsv() 等函数，可精确控制列类型与缺失值处理。
数据读取与类型定义
library(readr)
meta_data <- read_csv("metadata.csv", col_types = cols(
sample_id = col_character(),
disease_status = col_factor(c("Control", "Case"))
))该代码显式指定列类型，避免默认解析错误，提升可重复性。col_types 参数确保分类变量正确编码，防止后续分析偏差。
数据规整化处理
使用 tidyr 将宽表转为长格式，便于整合基因表达、甲基化等多组学数据：
library(tidyr)
expr_long <- pivot_longer(expr_data, cols = starts_with("gene"),
names_to = "gene_id", values_to = "expression")pivot_longer() 实现字段解构，starts_with 精准筛选列，生成标准化长格式数据。
| 原始列数 | 转换后行数 | 结构优势 |
|---|---|---|
| 100 | 9900 | 统一分析接口 |
整合流程可视化
graph TD
A[原始CSV/TSV] --> B{readr读取}
B --> C[类型校正]
C --> D{tidyr规整}
D --> E[长格式一致性数据]2.3 数据标准化与批次效应校正实战
在高通量组学数据分析中，不同实验批次引入的技术偏差常掩盖真实生物信号。为此，需先进行数据标准化，再实施批次校正。
标准化方法选择
常用TPM（转录本每百万）或CPM（每百万计数）对原始读数进行文库大小归一化。对于RNA-seq数据：
# 计算CPM并添加伪计数防止零值
cpm_data <- cpm(raw_count_matrix, log=FALSE) + 1raw_count_matrix为基因×样本的计数矩阵，cpm函数来自edgeR包，自动按文库规模缩放，+1用于后续对数转换稳定性。
批次效应校正流程
使用ComBat（来自sva包）消除已知批次影响：
library(sva)
combat_edata <- ComBat(dat = cpm_data, batch = batch_vector, mod = model.matrix(~condition))batch_vector标注样本所属批次，mod协变量矩阵保留生物学条件，避免将真实差异误判为批次噪声。
| 方法 | 适用场景 | 是否保留均值 |
|---|---|---|
| ComBat | 已知批次标签 | 是 |
| PCA+去噪 | 无批次标签探索性分析 | 否 |
校正效果可视化
可通过UMAP降维观察校正前后样本聚类变化，理想情况下同类样本按生物学条件聚集，而非按批次分离。
2.4 多组学数据矩阵整合策略
在多组学研究中，整合基因组、转录组、蛋白质组等异构数据是揭示生物系统复杂性的关键。为实现数据协同分析，需构建统一的特征空间并解决技术偏差。
数据对齐与标准化
不同组学平台产生的数据维度和量纲差异显著。常用Z-score或Quantile Normalization进行标准化处理：
from sklearn.preprocessing import StandardScaler
# 对每个组学矩阵独立标准化
scaler = StandardScaler()
omics_scaled = scaler.fit_transform(omics_data)该代码对单个组学矩阵按列（即每个特征）进行标准化，使其均值为0、方差为1，便于后续拼接与建模。
融合策略对比
| 方法 | 优点 | 局限性 |
|---|---|---|
| 串联融合 | 简单直观 | 忽略模态间相关性 |
| 中层融合 | 支持联合特征学习 | 需复杂模型设计 |
基于图的整合框架
使用mermaid描述典型流程：
graph TD
A[基因组矩阵] --> D(Integration Layer)
B[转录组矩阵] --> D
C[甲基化矩阵] --> D
D --> E[低维嵌入空间]该结构支持跨模态关联挖掘，提升下游聚类或分类性能。
2.5 基于R的表达量与代谢物丰度关联初探
在多组学数据整合分析中，探索基因表达量与代谢物丰度之间的潜在关联是理解生物调控机制的关键步骤。使用R语言可高效实现此类关联分析。
数据预处理与相关性计算
首先对表达量和代谢物数据进行标准化处理，确保量纲一致：
# 标准化数据
expr_scaled <- scale(expr_data)
metab_scaled <- scale(metab_data)
# 计算Pearson相关系数
cor_matrix <- cor(expr_scaled, metab_scaled, method = "pearson")scale()函数对数据进行Z-score标准化，消除量级差异；cor()函数逐列计算两组数据间的线性相关性，输出相关系数矩阵，为后续筛选显著关联提供基础。
显著性检验与结果可视化
通过p值校正控制多重检验误差，并筛选FDR
- 使用
Hmisc::rcorr()同时输出相关系数与p值 - 应用
p.adjust()进行Benjamini-Hochberg校正 - 构建热图或网络图展示关键关联模块
| 关联类型 | 样本数 | 相关方法 | 多重检验校正 |
|---|---|---|---|
| 表达-代谢 | 30 | Pearson | FDR (BH) |
多组学关联推断流程
graph TD
A[原始表达数据] --> B[标准化]
C[原始代谢数据] --> B
B --> D[计算相关矩阵]
D --> E[显著性检验]
E --> F[功能富集分析]第三章：GO功能富集分析实现路径
3.1 GO数据库结构与term分类机制详解
GO（Gene Ontology）数据库采用有向无环图（DAG）结构组织生物学概念，每个节点代表一个功能术语（term），边表示术语间的语义关系。与传统树形结构不同，DAG允许多父继承，更准确地反映基因功能的多维性。
核心表结构设计
| 字段名 | 类型 | 说明 |
|---|---|---|
| term_id | VARCHAR(10) | 唯一标识符，如 GO:0003674 |
| name | TEXT | 功能名称，如 “DNA binding” |
| namespace | ENUM | 所属本体域：BP/CC/MF |
| is_obsolete | BOOLEAN | 是否已废弃 |
Term分类机制
GO将术语划分为三个独立命名空间：
- BP（Biological Process）：生物过程
- CC（Cellular Component）：细胞组分
- MF（Molecular Function）：分子功能
-- 查询所有参与信号传导的分子功能
SELECT term_id, name
FROM go_term
WHERE namespace = 'MF'
AND name LIKE '%activity%'
AND is_obsolete = 0;该查询筛选出非废弃的分子功能类术语，通过关键词匹配定位特定功能子集，体现分类系统的可检索性与语义一致性。
关系建模示意图
graph TD
A[GO:0003674 DNA binding] --> B[GO:0005575 cellular_component]
A --> C[GO:0008150 biological_process]
D[GO:0003824 catalytic activity] --> A图中展示术语间“part_of”或“is_a”关系，构成复杂但逻辑清晰的功能网络。
3.2 利用clusterProfiler进行GO富集分析
GO（Gene Ontology）富集分析是解析高通量基因列表功能特征的核心手段。clusterProfiler 是 R 语言中广泛使用的功能富集分析工具，支持 GO、KEGG 等多种本体数据库。
安装与加载
# 安装并加载 clusterProfiler 包
if (!require("clusterProfiler")) {
BiocManager::install("clusterProfiler")
}
library(clusterProfiler)此代码确保
clusterProfiler及其依赖项正确安装。BiocManager是 Bioconductor 包的标准管理器，适用于生物信息学常用工具。
执行 GO 富集分析
# 假设 deg_genes 为差异表达基因的向量
ego <- enrichGO(gene = deg_genes,
OrgDb = org.Hs.eg.db, # 人类基因注释库
ont = "BP", # 分析生物学过程
pAdjustMethod = "BH", # 多重检验校正方法
pvalueCutoff = 0.05,
minGSSize = 10)
enrichGO函数执行核心分析：ont参数指定本体类型（BP/CC/MF），pAdjustMethod控制假阳性率，minGSSize过滤过小的功能类别。
结果可视化
| 图表类型 | 函数 | 用途 |
|---|---|---|
| 富集气泡图 | dotplot() |
展示显著条目与富集程度 |
| GO 层级结构图 | emapplot() |
揭示功能模块间关系 |
通过 dotplot(ego) 可快速识别主导生物学过程。
3.3 可视化GO富集结果：气泡图与条形图绘制技巧
数据准备与基础绘图
在完成GO富集分析后，清晰的可视化能显著提升结果解读效率。常用图表包括气泡图和条形图，分别适用于展示多维度信息与排名趋势。
气泡图绘制示例
library(ggplot2)
ggplot(go_data, aes(x = -log10(pvalue), y = Term, size = Count, color = GeneRatio)) +
geom_point() +
scale_color_gradient(low = "blue", high = "red") +
theme_minimal()代码逻辑：以
-log10(pvalue)表示显著性，Term为功能条目，size显示参与基因数，color编码富集比例。颜色梯度从蓝到红突出显著程度。
条形图参数优化
| 参数 | 作用 |
|---|---|
reorder(Term, pvalue) |
按显著性排序 |
coord_flip() |
横向排列便于阅读 |
scale_size(range = c(3, 10)) |
控制气泡尺寸范围 |
图表选择建议
- 气泡图：适合多变量场景，通过大小与颜色双重编码增强信息密度；
- 条形图：简洁直观，利于展示Top通路排名。
第四章：KEGG通路分析与联合注释
4.1 KEGG通路数据库核心概念与API调用方式
KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）是一个整合了基因组、化学和系统功能信息的综合性数据库，广泛应用于通路分析与功能注释。其核心由PATHWAY、GENE、COMPOUND等数据库构成，支持通过RESTful API进行程序化访问。
数据结构与命名体系
KEGG采用统一的标识符命名规则，如path:map00010表示糖酵解通路，hsa:10458代表人类特定基因。理解这些前缀对精准查询至关重要。
API调用示例
curl -s "https://rest.kegg.jp/get/hsa05200"该请求获取编号为05200的癌症通路详情。KEGG REST API无需认证，支持get、find、list等操作，返回纯文本格式数据，便于解析。
| 操作 | 资源类型 | 示例 |
|---|---|---|
| get | pathway, gene | get/hsa05200 |
| list | database | list/pathway |
数据获取流程
graph TD
A[构建API请求URL] --> B[发送HTTP请求]
B --> C{响应状态200?}
C -->|是| D[解析文本内容]
C -->|否| E[重试或报错]返回内容包含通路图注、基因列表及相互作用关系，可进一步用于可视化或富集分析。
4.2 基于clusterProfiler的KEGG富集分析流程
准备输入数据
进行KEGG富集分析前，需准备差异表达基因列表（DEGs），通常以基因ID向量形式提供。确保基因ID与所用生物体的注释数据库一致，如人类使用Entrez ID或Ensembl ID。
执行富集分析
使用clusterProfiler中的enrichKEGG()函数执行富集：
library(clusterProfiler)
ego <- enrichKEGG(gene = deg_list,
organism = "hsa",
pvalueCutoff = 0.05,
qvalueCutoff = 0.1)gene：输入差异基因列表；organism：指定物种（如hsa代表人类）；pvalueCutoff和qvalueCutoff：设定显著性阈值，控制结果严格度。
该函数基于超几何分布检验通路中基因的富集程度。
结果可视化
可进一步使用dotplot(ego)绘制富集结果点图，直观展示显著通路及其统计指标。
| 通路名称 | 基因数 | p值 | q值 |
|---|---|---|---|
| hsa04110: Cell cycle | 18 | 1.2e-6 | 3.5e-5 |
分析流程概览
graph TD
A[差异基因列表] --> B(enrichKEGG分析)
B --> C[富集结果对象]
C --> D[多重检验校正]
D --> E[可视化与解释]4.3 代谢通路映射：从差异基因到代谢物的路径还原
在组学研究中，差异表达基因如何影响下游代谢物变化是功能解析的关键环节。代谢通路映射通过整合转录组与代谢组数据，重建基因-酶-代谢物之间的生物化学关联。
通路注释与数据库匹配
常用KEGG、MetaCyc等数据库进行通路注释。通过基因ID映射至编码酶，再定位其催化的反应节点：
# 使用clusterProfiler进行KEGG富集分析
enrich_kegg <- enrichKEGG(gene = diff_genes,
organism = 'hsa',
pvalueCutoff = 0.05)该代码将差异基因映射至KEGG通路，organism='hsa'指定人类物种，pvalueCutoff筛选显著通路，输出结果包含涉及的代谢通路及富集程度。
多组学关联可视化
使用mermaid构建基因-代谢物路径推断流程：
graph TD
A[差异基因] --> B[编码酶预测]
B --> C[EC编号匹配]
C --> D[KEGG反应查询]
D --> E[代谢物节点定位]
E --> F[通路拓扑重构]此流程逐层解析从基因表达变化到代谢网络扰动的因果链条，实现分子表型的功能还原。
4.4 整合转录组与代谢组的KEGG双组分可视化
在多组学研究中，整合转录组与代谢组数据并映射至KEGG通路图，可直观揭示基因表达变化对代谢物丰度的影响机制。
数据同步机制
需将转录组差异基因与代谢组显著代谢物基于KEGG通路ID进行坐标对齐。常用pathview或mixOmics工具实现跨组学映射。
# 使用pathview绘制双组分图
pathview(gene.data = diff_expr,
cpd.data = metabolites,
pathway.id = "map00940",
species = "hsa")该代码将基因表达（gene.data）与代谢物水平（cpd.data）叠加至指定通路图。gene.data为归一化后的基因表达矩阵，cpd.data为定量代谢物向量，pathway.id指定胆碱代谢通路，species限定为人类参考图谱。
可视化逻辑解析
通过颜色梯度分别标注基因（上层）与代谢物（下层）的变化幅度，形成上下双色块结构。mermaid流程图展示整合流程：
graph TD
A[转录组数据] --> C(KEGG通路映射)
B[代谢组数据] --> C
C --> D[双组分热图]第五章：五步法总结与多组学研究前景
在多组学整合分析的实践中，我们逐步形成了一套可复用、可推广的“五步法”工作流程。该方法不仅适用于肿瘤微环境解析，也在神经退行性疾病、罕见病机制探索等场景中展现出强大适应性。以下是对该方法的系统性归纳，并结合前沿案例展望其未来发展方向。
数据采集标准化
高质量的数据是多组学分析的基石。建议采用统一采样协议，确保基因组、转录组、表观组和蛋白组样本来自同一生物个体且保存条件一致。例如，在一项帕金森病研究中，研究团队对30例患者脑组织进行四组学同步采集，使用QIAseq和Olink平台分别获取RNA-seq、WGS、ChIP-seq与SomaScan蛋白数据，显著提升了跨组学关联的可信度。
分析流程模块化
构建可插拔的分析流水线能极大提升效率。典型流程包括：
- 原始数据质控（FastQC, MultiQC）
- 组学特异性预处理（STAR/BWA/GATK）
- 批次效应校正（ComBat-seq）
- 多组学数据融合（MOFA+）
- 功能注释与可视化（GSEA, Cytoscape）
| 工具 | 用途 | 支持组学类型 |
|---|---|---|
| MOFA+ | 潜在因子建模 | 转录/甲基化/蛋白 |
| iClusterPlus | 分子分型 | 基因组+转录组 |
| mixOmics | 关联网络构建 | 多组学集成 |
跨组学关联挖掘
利用相关性网络或机器学习模型识别调控关系。某肝癌研究通过LASSO回归联合甲基化与mRNA表达数据，发现CDKN2A启动子区高甲基化与其表达沉默高度相关（r = -0.82, p
生物验证闭环
计算预测需实验反哺。推荐采用CRISPRi扰动目标位点后，检测下游基因表达变化。在结直肠癌类器官模型中，敲低预测的超级增强子后，其关联基因MYC表达下降70%，证实了调控逻辑的有效性。
临床转化路径
整合AI模型推动精准医疗落地。某三甲医院部署基于多组学特征的生存预测系统，输入患者WES、RNA-seq及血清蛋白谱，输出复发风险评分。经回顾性验证，AUC达0.89，已纳入术后随访决策支持流程。
graph LR
A[原始测序数据] --> B(质量控制)
B --> C{组学类型}
C --> D[基因组变异 calling]
C --> E[转录本定量]
C --> F[甲基化β值]
D & E & F --> G[数据标准化]
G --> H[MOFA+降维]
H --> I[识别共变模式]
I --> J[功能通路富集]
J --> K[候选靶点列表]随着单细胞多组学技术（如CITE-seq、scATAC+RNA）普及，五步法正向单细胞层级演进。某新冠研究利用10x Multiome平台解析感染后肺泡上皮细胞的染色质开放性与基因表达协同变化，揭示IFITM3增强子动态重塑过程，为宿主抗病毒机制提供新视角。
